Zelltests mit Liqcreate Bio-Med Clear - ein biokompatibles 3D-Druckharz

Der Rest des Experiments wurde im LAF-Schrank durchgeführt. Eine Greiner CELLSTAR® 24-Well-Platte wurde aus der Verpackung genommen und die Wells wurden auf der Unterseite mit einem Permanentmarker nummeriert. Dies geschah von rechts nach links und von oben nach unten, so dass die Reihenfolge auch dann stimmte, wenn die Platte umgedreht wurde. Mit einer Pinzette autoklavierte Bio-Med Clear In die ersten achtzehn Vertiefungen der Platte wurden Scheiben gelegt, eine Scheibe pro Vertiefung. Dann wurden 1.6 ml Bakteriensuspension des zu testenden Bakteriums in die ersten einundzwanzig Vertiefungen pipettiert. Auf diese Weise wurden auch drei Vertiefungen ohne Scheiben mit Bakteriensuspension gefüllt. Diese Vertiefungen dienten als positive Kontrollen. Um eine Kontamination zu verhindern, wurden 1.60 mL steriles BHI-Medium pro Experiment als negative Kontrolle in drei Vertiefungen einer separaten 24-Well-Platte pipettiert. Diese Platte wurde jedes Mal geöffnet, wenn eine Bakterienplatte eingesetzt wurde, und geschlossen, bis die nächste Platte eingesetzt wurde. Auf diese Weise waren die Bedingungen der eingesetzten Platten gleich, aber eine Kontamination durch beispielsweise Aerosolbildung wurde verhindert. Beide 24-Well-Platten wurden dann 48 Stunden bei 37 °C inkubiert.

Nach der Inkubation der Platten wurden die Testergebnisse generiert. Zunächst wurde eine Gram-Färbung der Suspension aus acht verschiedenen Vertiefungen der 24-Well-Platte durchgeführt. Die Gram-Präparate wurden unter einem Mikroskop untersucht, um das Vorhandensein von Bakterien in der Suspension zu überprüfen und die Bakterien zu identifizieren. Danach wurde die Bakteriensuspension aus denselben 8 Vertiefungen, aus denen zuvor die Gram-Färbung durchgeführt wurde, herauspipettiert. Die leeren Vertiefungen wurden mit 1.6 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Dazu wurde die Platte fünf Minuten lang in den Schüttelinkubator gestellt, der die Platte mit einer Geschwindigkeit von 200 U/min rotieren ließ. Auf diese Weise wurden alle Bakterien, die noch in der Vertiefung vorhanden waren, aber nicht an der Scheibe hafteten, weggespült. Nach dem Waschen wurden die Scheiben aus den Vertiefungen entfernt und in ein 5-ml-Falcon-Röhrchen mit 2 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung überführt. Diese Röhrchen wurden ebenfalls 30 Minuten lang in den Schüttelinkubator gestellt, damit alle Bakterien, die möglicherweise an der Scheibe hafteten, abgewaschen werden konnten. Anschließend wurden aus jedem Röhrchen 100 μl entnommen. Diese 100 μl wurden mithilfe der Ausstrichmethode und eines Dreiecksspatels auf VWR® Plate Count Agar plattiert. Zur Kontrolle wurde auch aus einer der leeren Vertiefungen der leeren 24-Well-Platte eine Ausstrichplatte hergestellt. Alle Ausstrichplatten wurden dann 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die PCA-Platten verwendet, um zu bestimmen, ob die Bakterien an den Bio-Med Clear Harz. Dies wurde durch Betrachtung des Koloniewachstums auf den PCA-Platten beurteilt. Wachstum auf den PCA-Platten zeigte an, dass sich Bakterien an der Scheibe festgesetzt hatten, und kein Wachstum bedeutete, dass sich keine Bakterien an der Scheibe festgesetzt hatten.

Testen von MDA-MB-175-VII-Zellen an Bio-Med Clear

Dieser Zelltest wurde in einer konfluenten T75-Flasche mit kultivierten MDA-MB-175-VII-Zellen durchgeführt. Während des Kultivierungsprozesses wurde die Zellsuspension regelmäßig gezählt, um die Vitalität und die Anzahl der lebenden Zellen genau im Auge zu behalten.

Zur Durchführung des Tests wurden die Zellen zunächst von der Wand des T75-Kolbens abgelöst, indem 3 mL Trypsin-EDTA 1x zum Kolben gegeben wurden. Der Kolben wurde dann fünf Minuten lang in einem 37 °C heißen Inkubator inkubiert, damit das Trypsin die Proteinbindungen lösen konnte. Nach fünf Minuten wurde der Kolben wieder in den LAF-Schrank gestellt, wonach die verbleibenden Zellen mit einem Schaber vom Boden abgelöst wurden. Um die Wirkung des Trypsins zu neutralisieren, wurden 30 ml RPMI-Zellkulturmedium von VWR® mit 10 % Avantor® Fetal Bovine Serum, vorgewärmt auf 37 °C, hinzugefügt. Die Zellen und das Medium wurden dann gemischt, indem die Flüssigkeit mehrmals mit einer Pipette auf- und abpipettiert wurde. Der gesamte Inhalt des T75-Kolbens wurde dann in ein 50-ml-Falcon-Zentrifugenröhrchen überführt. Zusätzlich wurde ein 15 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen im LAF-Schrank mit 10 ml sterilem RPMI-Zellkulturmedium gefüllt. Dieses Röhrchen wurde als Negativkontrolle verwendet.

Nach dem Herstellen der Zellsuspension wurde eine Greiner CELLSTAR® 24-Well-Platte aus der Verpackung entnommen. Die Wells wurden auf der Unterseite mit einem Permanentmarker nummeriert. Dies geschah von rechts nach links und von oben nach unten, sodass die Reihenfolge beim Umdrehen der Platte stimmte. Mit einer Pinzette autoklaviert Bio-Med Clear In die ersten achtzehn Vertiefungen der Platte wurden Scheiben gegeben, 1 Scheibe pro Vertiefung. Anschließend wurden 1.6 ml Zellsuspension in die ersten einundzwanzig Vertiefungen pipettiert. Dadurch wurden auch drei Vertiefungen ohne Scheiben mit Bakteriensuspension gefüllt, diese Vertiefungen dienten als positive Kontrollen. In die letzten drei Vertiefungen wurden 1.6 ml steriles RPMI-Zellkulturmedium pipettiert, diese Vertiefungen dienten als negative Kontrollen. Die 24-Well-Platte wurde dann 120 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.

Zur Generierung der Ergebnisse wurde die 24-Well-Platte täglich sowohl mikroskopisch als auch makroskopisch beurteilt. Makroskopisch wurde vor allem die Farbe und Trübung des Zellkulturmediums beobachtet, und mit Hilfe des ZOE Fluorescent Cell-Imager konnten die einzelnen Wells auch mikroskopisch beurteilt werden. Nach fünf Tagen wurden acht Scheiben aus den Wells entnommen. Diese Scheiben wurden dann auf einen Objektträger gelegt, sodass die Scheiben unter dem Mikroskop betrachtet werden konnten. Mithilfe des ZOE Fluorescent Cell-Imager und eines Rotlichtfilters konnte schließlich festgestellt werden, ob die Zellen am Kunststoff haften oder nicht.

Ergebnisse aus Bakterientests

Im Rahmen dieses Versuchs wurde untersucht, ob die Bakterienstämme Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi und Staphylococcus epidermidis die Fähigkeit besitzen, am Harz von Liqcreate Bio-Med Clear. Darüber hinaus wurde geprüft, ob Bio-Med Clear hat Einfluss auf das Wachstum und die Vermehrung der Bakterienstämme.

Um dies zu untersuchen, wurden 4 Experimente durchgeführt, bei denen Scheiben von Bio-Med Clear Harz wurde in 24-Well-Platten mit Bakteriensuspensionen von S. aureus, E. coli, S. epidermidis und S. typhi inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine Gram-Färbung von acht Wells jeder Platte durchgeführt, um zu prüfen, ob Bakterien in der Suspension vorhanden waren, und um die Bakterien zu bestimmen. Aufgrund der großen Anzahl von Ergebnissen wurde entschieden, nur die Ergebnisse der ausgestrichenen Platten zu diskutieren. Die Ergebnisse der 24-Well-Platten und Gram-Färbungen der vier durchgeführten Experimente werden in den Anhängen I bis IV ausführlicher erläutert.

Nach der Gram-Färbung wurden die Vertiefungen und Scheiben mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gespült. Die physiologische Kochsalzlösung wurde mithilfe der Plattenausbreitungsmethode auf PCA-Platten aufgebracht, wonach die PCA-Platten 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurden. Die Ergebnisse der PCA-Ausbreitungsplatten nach der Inkubation sind unten in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2: Fotos der PCA-Ausstrichplatten von Bakterientests S. aureus, E. coli, S. epidermidis und S. typhi mit Bio-Med Clear Harz nach 24 Stunden Inkubation.

In Tabelle 2 oben sind die Ergebnisse der vier durchgeführten Bakterientests in Form von PCA-Spreizplatten zu sehen. Auf den Fotos 1 und 2 sind PCA-Spreizplatten aus dem Bakterientest mit Staphylococcus aureus-Bakteriensuspension zu sehen, auf den Fotos 3 und 4 sind PCA-Spreizplatten aus dem Bakterientest mit Escherichia coli-Bakteriensuspension zu sehen, auf den Fotos 5 und 6 sind PCA-Spreizplatten aus dem Bakterientest mit Staphylococcus epidermidis-Bakteriensuspension zu sehen und auf den Fotos 7 und 8 sind PCA-Spreizplatten aus dem Bakterientest mit Salmonella typhi-Bakteriensuspension zu sehen.

Auf allen Platten ist ein deutliches Bakterienwachstum zu erkennen. Alle Platten zeigen reines Wachstum der jeweiligen Bakterienart ohne Anzeichen von Kontamination oder Anwesenheit der anderen Bakterienart. In allen vier Experimenten wurden auch positive und negative Kontrollen mitgeführt. Die PCA-Spread-Platten der positiven Kontrollen zeigten reines Wachstum der jeweiligen Bakterienart, und auch hier war keine Kontamination oder Anwesenheit der anderen Bakterienart zu erkennen. Für die negative Kontrolle wurde eine separate 24-Well-Platte entnommen, um auf diese Weise eine Arbeitskontamination zu verhindern. Von diesen Wells wurde ebenfalls ein sauberer Ausstrich gemacht, der auf Foto 9 in Tabelle 2 zu sehen ist. Hier ist deutlich zu erkennen, dass nach der Inkubation kein Bakterienwachstum auf der Platte auftrat. Dies deutet darauf hin, dass der gesamte Prozess steril durchgeführt wurde und nirgendwo eine Arbeitskontamination auftrat.

Ergebnisse von MDA-MB-175-VII-Zellen

Im Rahmen dieses Experiments wurde untersucht, ob MDA-MB-175-VII Zellen die Fähigkeit besitzen, an den Bio-Med Clear Harz. Um dies zu untersuchen, wurden Scheiben aus Bio-Med Clear Harz wurde in einer 24-Well-Platte mit einer Zellsuspension bestehend aus MDA-MB-175-VII-Zellen inkubiert. Die 24-Well-Platte wurde dann 120 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Um die Ergebnisse zu ermitteln, wurde die Platte täglich sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch überprüft. Unten in Abbildung 2 ist ein Bild der 24-Well-Platte nach 120 Stunden Inkubation zu sehen.

Die 24-Well-Platte des Humanzelltests ist genauso aufgebaut wie die 24-Well-Platten der Bakterientests. Die Wells sind von 1 bis 24 nummeriert, wobei das Well in der oberen linken Ecke die Nummer 1 ist. Die Nummerierung geht dann nach unten weiter, sodass das Well in der unteren linken Ecke die Nummer 4 ist. Die Nummerierung geht dann wieder von oben nach unten weiter, sodass das zweite Well in der oberen Reihe die Nummer 5 ist. Dies setzt sich über die gesamte Platte von oben nach unten fort.

Die ersten 18 Vertiefungen enthalten sowohl eine Scheibe als auch eine Bakteriensuspension. Diese Vertiefungen sind auf dem Foto oben an ihrer rosa/hellorangen Farbe zu erkennen. Als nächstes gibt es 3 Vertiefungen mit nur Zellsuspension (Vertiefung 19, 20 und 21). Diese Vertiefungen sind an ihrer hellrosa Farbe zu erkennen und werden in diesem Experiment als positive Kontrolle verwendet. Die letzten 3 Vertiefungen der Platte enthalten nur steriles RPMI-Kulturmedium mit 10 % FCS und werden in diesem Experiment als negative Kontrolle verwendet.

Das Medium in den Vertiefungen mit einem Bio-Med Clear Die Scheibe ist nach 120 Stunden Inkubation immer noch klar gefärbt, was darauf hinweist, dass in diesen Vertiefungen keine Kontamination aufgetreten ist. Das Medium in diesen Vertiefungen hat im Vergleich zu den positiven Kontrollvertiefungen eine leicht andere Farbe, aber das liegt daran, dass die Bio-Med Clear Die Harzscheibe hat eine eigene gelbe Farbe. Dadurch erscheint die Farbe der Flüssigkeit in den Vertiefungen von oben ebenfalls gelb/orange gefärbt. Von der Seite sah das Medium rosa aus und die Farbe stimmte mit der Farbe der positiven Kontrollvertiefungen überein. Dies war jedoch auf dem Foto schwer festzuhalten. Das Medium in den Vertiefungen der positiven Kontrolle hat auch nach 120 Stunden Inkubation noch eine klare Farbe, was darauf hinweist, dass in diesen Vertiefungen keine Kontamination aufgetreten ist. In den Vertiefungen der negativen Kontrolle ist das Medium in einer der drei Vertiefungen (Vertiefung 22) nach etwa 4 Tagen trüb geworden. Die Ursache dafür ist unklar, aber es weist darauf hin, dass sich in der Vertiefung eine gewisse Kontamination befindet, was bedeutet, dass diese Kontrolle möglicherweise nicht zugelassen ist.

Da die Kontamination in der Negativkontrolle nur in 1 der 3 Vertiefungen auftrat, wurde nach Rücksprache mit den Experten entschieden, die restlichen Testergebnisse zu interpretieren. In den anderen 2 Vertiefungen der Negativkontrolle gibt es keinen weiteren Hinweis auf eine Kontamination, da die Flüssigkeit in diesen Vertiefungen einfach klar ist und eine schöne dunkelrosa Farbe aufweist. Dies bedeutet wahrscheinlich, dass es eine Arbeitskontamination gab, die während der Verwendung des Tests aufgetreten ist. Nach 120 Stunden wurde die Flüssigkeit aus der kontaminierten Negativkontrollvertiefung pipettiert, damit sich die Kontamination nicht weiter über die Platte ausbreiten konnte. Die Ergebnisse des Tests wurden dann mithilfe des ZOE Fluorescent Cell-Imager generiert.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Prüfung der Adhäsionskapazität von MDA-MB-175-VII-Zellen an Bio-Med Clear Scheiben. Die Scheiben wurden mit einer Pinzette aus den Vertiefungen der 24-Well-Platte in Abbildung entfernt und auf einem Objektträger mit dem ZOE® Fluorescent Cell-Imager betrachtet. Für den Kunststoff Bio-Med Clear Bei den Scheiben entschied man sich für eine Betrachtung mit roter Fluoreszenz (siehe auch Fotos 1 bis 7 in Tabelle 3), da dieser Filter die klarsten Ergebnisse liefern konnte. Der Kunststoff ist 3D-gedruckt, das heißt, er wird schichtweise aufgebaut. Der Kunststoff ist daher auf den Fotos 1 bis 7 gut an seiner gerippten Struktur zu erkennen.

Alle sieben in Tabelle 3 gezeigten Scheiben weisen Flecken auf dem Kunststoff auf. Dies deutet darauf hin, dass sich die Zellen während des Inkubationsprozesses am Kunststoff festgesetzt haben und dass die Zellen um den Kunststoff herum wachsen können. Auf Foto 8 ist ein Bild der positiven Kontrollvertiefung sichtbar. Dieses Foto wurde mit einem normalen Lichtfilter aufgenommen, und es ist deutlich zu erkennen, dass die Zellen in diesem Bild den Zellen/Flecken entsprechen, die auf den Fotos 1 bis 7 um den Kunststoff herum sichtbar sind. Bio-Med Clear Scheibe. Auf Foto 9 ist ein Bild der Negativkontrollvertiefung sichtbar. In diesem Medium sind keine Zellen oder andere Faktoren oder Verunreinigungen vorhanden. Dies zeigt an, dass die Verunreinigung aus Vertiefung 22 nicht auf die anderen Negativkontrollvertiefungen übertragen wurde.

Da die positiven und negativen Kontrollvertiefungen keine Scheibe enthielten, war es möglich, die Vertiefungen selbst direkt unter dem Mikroskop zu betrachten. Dies war bei den anderen Vertiefungen nicht möglich, da nicht festgestellt werden konnte, ob die Zellen am Kunststoff oder am Boden der Vertiefungen hafteten.

Fazit

Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von Bio-Med Clear 3D-druckbarer Kunststoff auf die Haftung, das Wachstum, die Zellteilung und das Überleben verschiedener Zellkulturen und Bakterien in einer kontrollierten Laborumgebung. Diese Studie zeigte, dass sowohl Bakterienzellen (S. aureus, S. epidermis, E. coli und S. typhi) als auch menschliche Zellen (MDA-MB-175-VII) an den Bio-Med Clear Harz. Alle Experimente zeigten, dass der Kunststoff das Wachstum und die Vermehrung der Zellen und Bakterien nicht weiter beeinflusst, denn nach der Inkubation mit dem Kunststoff Bio-Med Clear Harzscheiben, sowohl Bakterienwachstum als auch Zellwachstum waren im Vergleich zur positiven Kontrolle ähnlich. Dies deutet darauf hin, dass keine schädlichen monomers werden aus dem Kunststoff freigesetzt, was bestätigt, dass der Kunststoff gut genug ausgehärtet ist und dass der Aushärtungs- und Waschprozess vom Unternehmen effizient durchgeführt wurde Liqcreate. Aus diesen Erkenntnissen lässt sich schlussfolgern, dass Bio-Med Clear ist für Anwendungen geeignet, bei denen diese biologische Verträglichkeit erforderlich ist.